Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz

Diplomarbeit aus dem Jahr 2009 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: 1,3, Universitt Potsdam (Robert Koch-Institut), Sprache: Deutsch, Abstract: Die Xenotransplantation vom Schwein auf den Menschen ist mit dem Risiko der bertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) verbunden, die im Genom jeder Zelle des Schweins integriert sind und sich nicht durch DPF-(designated pathogen free) Zucht eliminieren lassen. PERVs infizieren humane Zellen in vitro, womit die Mglichkeit einer in vivo Infektion des humanen immunsuppremierten Rezipienten nicht ausgeschlossen werden kann. In den letzten Jahren wurde deshalb nach Mglichkeiten gesucht, die bertragung zu verhindern. Die RNA-Interferenz stellt hierbei eine vielversprechende Strategie dar, da sie die Replikation von PERV posttranskriptional unterbinden kann. So gelang es, transgene Schweine zu generieren, die in der Lage waren, shRNAs stabil zu exprimieren.
In isolierten primren Fibroblasten der transgenen Schweine wurde das fluoreszierende GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie die Integration des Transgens mittels PCR nachgewiesen, indem zum einen das gfp-Gen und der verwendete lentivirale Vektor, als auch die Expressionskassette der shRNA detektiert wurden. Alle entnommenen primren Fibroblasten enthielten Proviren der Subtypen A, B und C, die mittels PCR nachgewiesen wurden. Zudem konnte die Expression der Volllngen-mRNA sowie gespleiter env-mRNA mittels RT-PCR gezeigt werden. Um die Sensitivitt der Nachweismethoden der PERV-Expression zu erhhen, wurde eine neue one-step RT real-time PCR unter Verwendung neuer Primer und Sonde etabliert. Dadurch konnte eine verbesserte Detektion der shRNA-induzierten Hemmung der PERV-Expression um bis zu 93 % anstelle frherer 70 % nachgewiesen werden.
Um die Effektivitt der RNA-Interferenz weiter zu erhhen, wurden neue PERV-mRNA-spezifische shRNAs generiert und mit der bisher verwendeten shRNA zu Tandems kombiniert. Nach der Klonierung der