Analyse von Protein-Phosphorylierungsgraden mit Massenspektrometrie

Reversible Proteinphosphorylierung ist ein Schl sselprinzip der intrazellul ren Signaltransduktion. One-source-Peptid-/Phosphopeptid-standards wurden mit dem Ziel entwickelt, Phosphorylierungsgrade von Proteinen positionsspezifisch und mit hoher Genauigkeit zu bestimmen. Kernpunkt der Methode ist die Erzeugung einer Mischung eines stabilisotopenmarkierten Peptid-/Phosphopeptid-Standardpaars, dessen st chiometrisches Verh ltnis exakt bekannt ist. Die Standards wurden Proteinverdaus zugesetzt und diese mittels Fl ssigchromatographie und Massenspektrometrie analysiert. Im Vordergrund dieser Arbeit steht die Analyse der dualen ERK1/2-Phosphorylierung durch die MAPK-Kinase MEK. Die ERK-Signalkaskade spielt eine zentrale Rolle in der Antwort von Zellen auf extrazellul re Stimuli wie Wachstumsfaktoren und Zytokine. Dennoch sind die Mechanismen der dynamischen ERK-Aktivierung und -Deaktivierung in vivo nicht vollst ndig verstanden. Mit Hilfe von one-source-Standards wurde erstmals ein zweistufiger, distributiver ERK-Phosphorylierungsmechanismus in prim ren Maushepatozyten nachgewiesen.